前言：香料自古以來就被用于食品的調(diào)味和著色。歐洲國家發(fā)生過很多香料安全性警 告事件，涉及不同種類的污染物。因此，通過一種多殘留分析方法同時(shí)篩查和 定量農(nóng)藥、真菌毒素以及著色劑的需求越來越迫切。這類分析面臨的主要挑戰(zhàn) 包括復(fù)雜的基質(zhì)、大量的分析物、化合物種類的多樣性，以及分析方法必須覆 蓋寬泛的濃度范圍等。 本應(yīng)用簡報(bào)評(píng)估了在動(dòng)態(tài) MRM 和快速極性切換模式下運(yùn)行的離子漏斗三重四極 桿質(zhì)譜儀對(duì)一系列痕量水平分析物進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析的性能。

此外，我們還評(píng) 估了旨在優(yōu)化 MRM 間延遲時(shí)間的改良版軟件和固件，其能夠在低至 0.5 ms 的駐 留時(shí)間內(nèi)獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)。 Agilent 6495B 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)具有優(yōu)異的靈敏度，能夠定量高度 稀釋的樣品中的農(nóng)藥、真菌毒素和著色劑，在降低基質(zhì)效應(yīng)的同時(shí)提高方法穩(wěn) 定性。

實(shí)驗(yàn)部分 樣品前處理 黑胡椒和辣椒粉購自當(dāng)?shù)仉s貨店，按 照 EN 15662 QuEChERS 前處理方法， 使用 Agilent BondElut QuEChERS 試劑 盒（部件號(hào) 5982-6650）進(jìn)行提取。 使用 QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增強(qiáng) 型脂質(zhì)去除凈化基質(zhì)試劑盒（部件 號(hào) 5982-1010）進(jìn)一步純化提取物， 然后進(jìn)行 Polish 凈化鹽析萃?。ú考?號(hào) 5982-0102）。最后，向提取物中加 入 2 ppb (10 µg/kg) 安捷倫綜合農(nóng)藥混 標(biāo)（部件號(hào) 5190-0551）、真菌毒素以 及著色劑標(biāo)準(zhǔn)品 (Sigma)，再用乙腈以 1:5、1:10、1:20、1:50 和 1:100 的比例 稀釋加標(biāo)后的提取物。 方法設(shè)計(jì) 使用 Agilent MassHunter 優(yōu)化軟件優(yōu)化 五種真菌毒素和九種著色劑的 MRM 離子對(duì)，并使用安捷倫農(nóng)藥觸發(fā)式多 反應(yīng)監(jiān)測 (tMRM) LC/MS 應(yīng)用套裝為 每種化合物確定至少兩個(gè) MRM 離子 對(duì)及其對(duì)應(yīng)的 MS 條件。采用正離子 和負(fù)離子電噴霧電離，在動(dòng)態(tài) MRM (dMRM) 或 tMRM 模式下通過單次運(yùn) 行執(zhí)行分析。主要的 UHPLC 和 dMRM MS 參數(shù)如儀器條件表所示。

結(jié)果與討論：評(píng)估經(jīng)優(yōu)化的 MRM 間延遲時(shí)間 我們開發(fā)了以 100 個(gè) MRM 離子對(duì)（代 表 53 種農(nóng)藥）為分析目標(biāo)的方法，用 于評(píng)估優(yōu)化了 MRM 間延遲時(shí)間的改 良版軟件和固件。圖 1 顯示了四個(gè)不 同的駐留時(shí)間內(nèi)兩種農(nóng)藥的疊加 MRM 色譜圖，表明合適的 MRM 延遲時(shí)間 對(duì)于在短駐留時(shí)間內(nèi)保持離子信號(hào)非 常重要。

方法開發(fā)及性能 我們首先采用針對(duì)目標(biāo)真菌毒素和著 色劑化合物進(jìn)行了優(yōu)化的新離子對(duì)開 發(fā)了 MRM 方法。隨后，使用新的化 合物離子對(duì)和觀察到的保留時(shí)間數(shù)據(jù) 更新以 250 多種農(nóng)藥為目標(biāo)的 dMRM 方法。 UHPLC 與經(jīng)過優(yōu)化的 6495B 三重四極 桿質(zhì)譜儀相結(jié)合，能夠在大多數(shù)分析 物最大殘留* (MRL) 10% 的定量下 限 (LLOQ) 水平對(duì)其進(jìn)行定量分析。在 低至 2 ppt 的 LLOQ 到高至 100 ppb 的定 量上限 (ULOQ) 范圍內(nèi)，采用 13 個(gè)濃 度水平的標(biāo)樣評(píng)估方法的精度和準(zhǔn)確 度，每個(gè)濃度執(zhí)行五次重復(fù)進(jìn)樣。所 得結(jié)果表明，分析的精度（LLOQ 處的 RSD% < 20%，其余濃度水平 < 15%） 和平均準(zhǔn)確度（LLOQ 處為 80%-125%， 其余濃度水平為 85%-115%）都很出色。 校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù) (R2 ) 大于 0.99。

通過稀釋提取物最大限度降低基 質(zhì)效應(yīng) 對(duì)復(fù)雜樣品提取物進(jìn)行稀釋能夠最大 限度降低基質(zhì)效應(yīng)，使得定量分析更 加準(zhǔn)確，同時(shí)還能減少液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) 所受的污染，從而提高分析穩(wěn)定性。 表 1 顯示了稀釋操作對(duì)分析結(jié)果的改 善，其中黑胡椒樣品中化合物的回收 率隨著樣品被進(jìn)一步稀釋而提高。 香料是一類非常具有挑戰(zhàn)性的食品基 質(zhì)，它們的性質(zhì)很復(fù)雜，因而離子抑 制效應(yīng)極為顯著。由于觀察到了著色 劑化合物損失，我們不能利用傳統(tǒng)分 散式固相萃取凈化來去除干擾性基質(zhì) 化合物，這又導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)一步增 強(qiáng)。因此，稀釋提取物對(duì)于降低離子 抑制效應(yīng)而言十分關(guān)鍵，圖 4 中的對(duì) 比結(jié)果表明，不同類型的香料適用的 稀釋比例差別非常大。 我們所分析的樣品中具挑戰(zhàn)性的 香料基質(zhì)是黑胡椒。圖 5 表明，要使 化合物回收率達(dá)到 > 90% 的可接受標(biāo) 準(zhǔn)，需要使用乙腈以 1:100 的比例稀釋 提取物。6495B 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)固有的靈 敏度能夠有效分析以適合比例 1:100 稀釋的黑胡椒樣品，同時(shí)仍能檢出大 多數(shù)化合物，且峰面積 RSD < 20%。

使用觸發(fā)式多反應(yīng)監(jiān)測 (tMRM) 進(jìn)行確證分析 使用 dMRM 方法評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)時(shí)， 我們發(fā)現(xiàn)辣椒粉的空白提取液（未加 標(biāo)）中存在 20 多種農(nóng)藥和真菌毒素。 為了進(jìn)一步確認(rèn)此對(duì)照樣品中的這些 化合物，我們使用 tMRM 方法，在一 個(gè)主要離子對(duì)的基礎(chǔ)上采集了多達(dá)六個(gè)離子對(duì)，然后將完整的化合物譜圖 與采用純標(biāo)準(zhǔn)品創(chuàng)建的譜庫進(jìn)行比 對(duì)。定量分析也使用相同的數(shù)據(jù)。在 圖 6 所示的例子中，以 1:20 比例稀釋的 辣椒粉提取物中赭曲霉毒素 A 和黃qu霉毒素 B1 的計(jì)算結(jié)果分別為 28 µg/kg 和 8.1 µg/kg。

結(jié)論 • 使用優(yōu)化的 MRM 間延遲時(shí)間能 夠?qū)⑺?MRM 駐留時(shí)間縮短至 0.5 ms，同時(shí)最大限度減小分析 物信號(hào)損失 • 真菌毒素和著色劑化合物被成 功納入 UHPLC/MS/MS 農(nóng)藥方 法的目標(biāo)分析物中，用于測定 260 余種化合物 • 使用 Agilent 6495B 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)可提高分析靈敏度，定量高度稀釋的香料提取物中的 化合物，同時(shí)降低基質(zhì)效應(yīng)并 提高方法穩(wěn)定性 • 本文還給出了香料中真菌毒素 化合物的確證分析所用的 tMRM 采集參數(shù)