簡介：游離脂肪酸和構成復合脂質的脂肪酸都在代謝中發(fā)揮著一些關鍵作用 ——作為主要的代謝燃料(儲存和運輸能量)、所有細胞膜成分和基因調控因子。此外，膳食中的脂質可提供多不飽和脂肪酸， 這類脂肪酸是功能強大的局部作用代謝產(chǎn)物(如類花生酸)的前體。 常見的動植物來源脂肪酸均為偶數(shù)鏈，每條鏈含16至24個碳原子，并 具有0到6個雙鍵。但是大自然中總有著無數(shù)的例外，實際上甚至還存 在多達近100個碳原子的奇數(shù)碳和偶數(shù)碳脂肪酸。此外，雙鍵可以為順 式(Z)和反式(E)構型，也可以具有各種其它結構特征，包括分支點、環(huán)、 含氧官能團等等。 脂肪酸鏈可以在特定的位點含有一個或多個雙鍵(具有順式(Z)或反式(E) 構型的不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸)，也可以是*飽和的。 LIPIDMAPS脂肪酸系統(tǒng)命名法用“?”指示雙鍵相對于羧基的位置1 。脂肪酸 結構在分子的一端(Omega，ω)含有一個甲基，另一端為羧基。 靠近羧基的碳原子稱為α碳，緊接著下一個碳原子則稱為β碳。通常，還 會使用字母“n”代替ω，以指示離甲基端最近的雙鍵位置2 。圖1展示了不 同直鏈脂肪酸的結構。 從生物材料中分離游離脂肪酸(FFA)是一項復雜的工作，必須隨時注意防 止或盡量減少水解酶的影響。完成分離后，可通過典型的色譜方法對脂 肪酸進行分析，包括氣相色譜/質譜法(GC/MS)和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC/ MS/MS)。但是，這些方法都有著各自的不足之處。 例如，GC法需要將脂肪酸進行衍生化，以便水解并轉化為甲酯，這一過 程不僅耗時，而且在衍生化過程中還存在脂肪酸重排的風險，使得無法 確定形成的酯是來自FFA還是完整的復合脂質。此外，對于具有高分子量 (>C24)的低揮發(fā)性極長鏈脂肪酸來說，即使在脂肪酸甲酯(FAME)衍生化后， 其GC/MS分析依然存在問題。

在LC/MS方法中，雖然不需要進行樣品衍生化，但運行前的樣品制備過程費時費力，并且采用 的毒性有機溶劑價格昂貴，處理費用也很高。而在典型的反相(RP) LC/MS分析中，則必須將含 有所有脂質的有機提取物蒸干，再使用相容性更好的進樣溶劑進行復溶。 因此，如果有一種簡便的脂肪酸分離和測定方法，將會有很大幫助。我們在此展示了一種快 速、高通量和高效的FFA分離和分析方法，其中采用了帶有質譜分析的超高效合相色譜(UPCC 或UPC2 )。 UPC2 是一種互補的正交分離技術，正逐漸成為與LC和GC并列的第三大技術。盡管這三種技術 都是利用固定相與目標化合物相互作用，并利用流動相使化合物移動通過固定相，從而實現(xiàn) 分離，但它們所采用的流動相卻有所不同。 GC采用氣體作為流動相，LC使用液體作為流動相，而CC則同時使用了氣體和液體。正是這種 流動相的合并以及更多的固定相選擇使得CC成為實驗室科學家的又一個強大選擇。由于UPC2 可以分析溶于有機溶劑(例如己烷和氯仿)中的樣品，因此大大簡化了對于樣品制備的要求， 同時還保留了RPLC的所有優(yōu)勢。 在此，對游離形式的脂肪酸而非FAME衍生物的分析實現(xiàn)了更簡單快速的樣品制備。含有全部 FFA的有機相提取物可以直接注入系統(tǒng)中，顯著節(jié)省了樣品制備和分析時間、溶劑成本和溶劑 棄置處理成本。此外，還避免了衍生化步驟造成的干擾形成。

實驗 方法條件 UPC2 條件 系統(tǒng)： ACQUITY UPC2 色譜柱： ACQUITY UPC2 HSS C18 SB 1.8 µm, 2.1 x 150 mm 柱溫： 50 ?C 樣品瓶： 總回收樣品瓶 (p/n 186000385C) 樣品溫度： 10 ?C 進樣體積： 0.5 µL 流速： 0.6 mL/min 流動相A： CO2 流動相B： 甲醇的0.1%甲酸溶液 補償液： 甲醇的0.1% NH4OH溶液 (0.2 mL/min) 分流器： Upchurch四通1/16 PEEK 梯度 時間(min) %A (CO 2) %B 曲線 0.0 95 5 初始 5.0 75 25 6 5.1 50 50 1 6.0 50 50 11 8.0 95 5 1 MS 條件 質譜儀： Xevo G2 QTof 電離模式： ESI毛細管電壓： 1.0 kV 錐孔電壓： 30 V 源溫度： 100 ?C 脫溶劑氣溫度： 500 ?C 錐孔氣體流速： 10 L/h 脫溶劑氣流速： 600 L/h 采集范圍： 50-600 m/z

樣品制備 FFA標準混合物 各種含偶數(shù)個碳原子C8至C24的飽和FFA標準品購自Sigma公司。不同 FFA標準品(GLC-85，F(xiàn)FA形式)的復雜模型混合物購自Nu-Chek Prep(美國 明尼蘇達州伊利森)。表1列出了所分析的FFA標準品及其它詳細信息。 用氯仿制備1 mg/mL儲液和0.1 mg/mL工作脂質混合溶液，然后注入 UPC2 /MS系統(tǒng)中。 海藻和藻質素產(chǎn)油 海藻和藻質素在較低和較高的熱解溫度下進行加水熱解所產(chǎn)生的油 由歐道明大學(美國弗吉尼亞州諾福克)提供。在(310 ?C)的熱解溫度 下對海藻1和藻質素1進行處理；在(360 ?C)的熱解溫度下對海藻2和 藻質素2進行處理。 通過改良的提取步驟提取藻質素。簡而言之，使用1:1 (v/v)苯/甲醇溶 劑混合物，并采用索氏抽提法提取24小時，去除海藻中的脂質。在 60 ?C下，將殘留物質用2N氫氧化鈉處理兩小時。使用過量去離子水 洗滌剩下的殘留物質，接著用Dowex 50W-x8陽離子交換樹脂進行處理， 置換所有殘留的鈉。最后，用去離子沖洗固體。用二氯甲烷將油樣 稀釋10倍，取1 µL注入UPC2 /MS系統(tǒng)中。 數(shù)據(jù)采集和處理 通過多變量數(shù)據(jù)分析進行樣品對比時，關鍵在于使每個樣品隨機化 并至少進樣三次，以確保數(shù)據(jù)分析在統(tǒng)計學上有效。對于此項研究， 在MSE 模式下采集了每種海藻和藻質素油提取物的五次重復進樣，該 模式是一種無偏差的Tof采集方法，其中當進行交替掃描時質譜儀在 低碰撞能量和高碰撞能量之間切換。采用TransOmics代謝組學和脂類 組學信息學軟件(TransOmics Informatics for Metabolomics and Lipidomics，TOIML) 進行數(shù)據(jù)分析和FFA鑒定。

結果與討論 飽和FFA標準品的分析 圖2顯示了碳鏈長度為C8至C24的飽和FFA的分離。ACQUITY UPC2 高強度硅膠顆粒(HSS) C18 SB 1.8 µm， 2.1 x 150 mm色譜柱提供了類RP分離，可實現(xiàn)不同種類FFA的有效分離。在酸性條件下，采用比例 較小的甲酸(0.1% v/v甲醇溶液)運行梯度，以改善峰形并減少峰拖尾現(xiàn)象。 ACQUITY UPC2 方法比GC/MS和RPLC方法快10倍(運行時間僅需三分鐘)，并且使用毒性較小、更為經(jīng) 濟的CO2作為溶劑。典型的脂類組學研究涉及上千個生物樣品的分析，更快的速度意味著可以 高效地分析較大的樣品量，從而提升了實驗的整體效率。 FFA脂質分子的分離原理主要基于FFA碳數(shù)量和雙鍵數(shù)量與HSS C18 SB材料之間的疏水性相互作用。 因此，不同F(xiàn)FA的洗脫順序取決于脂肪酸鏈的長度和雙鍵數(shù)量。酰基鏈越長、越飽和，保留時 間也就越長。 通過優(yōu)化共溶劑流動相B(甲醇的0.1%甲酸溶液)，可以增加色譜分離度和峰容量。共溶劑的百 分比越高，保留時間就越短并且峰越窄。但是，在分析含有碳鏈長度不同的飽和與不飽和FFA 的復雜生物樣品時，峰容量對于減少共洗脫脂質非常重要。因此，我們采用甲醇的0.1%甲酸溶 液以5%至25%的共溶劑梯度進行進一步的分析。