特邀：海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室林桓課題組

林桓，海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副研究員，海南省領(lǐng)軍人才，《Marine Resource and Ocean Science》編委，曾任島津制作所全球應(yīng)用技術(shù)開發(fā)中心副主任研究員。主要研究領(lǐng)域是基于高分辨以及定量質(zhì)譜的核酸修飾生理學(xué)意義挖掘，在《Nature Communications》，Nucleic Acid Research等重要期刊發(fā)表過論文。

海南大學(xué)林桓副研究員團(tuán)隊(duì)以模式藍(lán)藻（細(xì)長聚球藻 PCC 7942）為研究對象，與島津廣州分析中心展開深入合作，通過微流液相色譜儀（島津Nexera Mikros）結(jié)合三重四級桿質(zhì)譜儀（島津LCMS-8050）建立了一套兼具靈敏度與特異性的修飾核苷鑒定方法，并對細(xì)長聚球藻PCC 7942 總tRNA組分中存在的修飾核苷進(jìn)行了檢測分析，為修飾核苷的鑒定提供了一種新思路。成果于2021年7月發(fā)表在《Journal of Separation Science》。

生物體中的RNA元件，包括核糖體RNA，信使RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，剪接體RNA，miRNA等，均需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后修飾成為成熟的分子。這些修飾對實(shí)現(xiàn)RNA元件的功能至關(guān)重要，例如新冠病毒mRNA疫苗必須在RNA鏈上摻入修飾核苷才能在人體中穩(wěn)定表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)錄后修飾主要發(fā)生在核糖核苷（A/U/C/G）的堿基或核糖上，以共價(jià)結(jié)合的方式連接一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)。近年研究表明RNA修飾種類和修飾率的變化參與到RNA代謝及功能實(shí)現(xiàn)的全過程，具有重要生理學(xué)意義[1-5]。

☆ 新思路 ☆

分析方法靈敏度提高有三種途徑：

•更高效的前處理技術(shù)以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的富集和基質(zhì)/雜質(zhì)的清除；

•更*的分離手段，得到更純、更集中流出的色譜峰以提高目標(biāo)物的瞬間濃度；

•更先進(jìn)的檢測技術(shù)以提高目標(biāo)物信號響應(yīng)。

目前質(zhì)譜儀因其通用性高、選擇性好和靈敏度高，是主流的檢測技術(shù)，其中，靈敏度是評價(jià)質(zhì)譜等級的重要指標(biāo)之一。質(zhì)譜儀的靈敏度受多方面影響，其中可以通過降低進(jìn)入離子源的液流，有效提高離子化效率，從而較大提高質(zhì)譜檢測靈敏度。如目前比較常見的Nano液相、Micro液相和Semi-micro常規(guī)分析型液相，我們來做一下性能對比。

三種液相系統(tǒng)的性能對比

Nano液相的液量有利于LCMSMS離子源的去溶劑化，從而提高質(zhì)譜響應(yīng)。但是由于液流過低，其通量較?。涣硗?，納升級的流速對輸液泵的精度和脈沖控制要求非常高，再加上其精密的部件對使用和維護(hù)都有很高的要求。故現(xiàn)有技術(shù)下Nano液相的通量和穩(wěn)定性無法達(dá)到常規(guī)分析型液相的水平。而Semi-micro常規(guī)型液相已成為相對成熟、應(yīng)用范圍相對廣的分析手段，這兩項(xiàng)指標(biāo)非常優(yōu)異，但是，由于較大的液流，導(dǎo)致進(jìn)入離子源，尤其是ESI離子源之后，其去溶劑化效率較差，靈敏度無法進(jìn)一步提高。

Micro液相的色譜柱內(nèi)徑介于0.1~1.0 mm之間，流速一般介于1~100 μL之間，這一流速下的儀器穩(wěn)定性、耐用性和維護(hù)性都比Nano液相有大幅提高，通量接近半微量分析型液相，而其去離子效率相比半微量分析型液相大大提高。因此Micro液相沒有明顯的短板，理論上是三種液相中相對理想的技術(shù)。

島津微流量液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) Mikros-LC+LCMS-8060

☆ 成果快覽 ☆

•在本研究中研究人員報(bào)道了尿苷及其衍生物在低溫及高有機(jī)溶劑的條件下容易析出造成信號變動，指出了利用HILIC等親水原理的核苷酸LCMS分析中需要注意的問題。

•利用島津微流量液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)測試了總tRNA組分中24個(gè)核苷標(biāo)樣，確定了各個(gè)標(biāo)樣所用的母離子和子離子，以及在HILIC色譜柱中的保留時(shí)間。通過多反應(yīng)監(jiān)測及保留時(shí)間，可以區(qū)分這些修飾核苷及其同分異構(gòu)體。

核苷標(biāo)樣微流量液質(zhì)系統(tǒng)色譜圖

•測定了24個(gè)修飾核苷標(biāo)樣的最小檢出量，運(yùn)用微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢出下限為0.1-1 fmol，而一般用于鑒定修飾核苷所用的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢出下限為1-10 fmol。

•運(yùn)用上述建立的方法，對細(xì)長聚球藻 PCC 7942中的修飾核苷進(jìn)行定量檢測，僅需含25 ng總tRNA組分的樣品，即可得到清晰的質(zhì)譜結(jié)果，而在傳統(tǒng)的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀上得到相同結(jié)果，至少需要含100 ng的總tRNA組分的樣品[6, 7]。

細(xì)長聚球藻樣品圖

☆ 專家觀點(diǎn) ☆

海南大學(xué)林桓副研究員：修飾核苷中尿嘧啶核苷及其衍生物電離困難及各修飾核苷同分異構(gòu)體之間不易區(qū)分的特點(diǎn)一直是質(zhì)譜檢測的難點(diǎn)。同時(shí)常規(guī)的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢出限較高，需要的樣品量較大，這也是不易提取的樣品檢測的制約條件之一。該研究依托島津公司強(qiáng)大的質(zhì)譜分析平臺，首次使用微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀分離鑒定總tRNA組分中的修飾核苷，靈敏度較半微流液相色譜——三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀提高了10倍以上。該方法可支持表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Lin H, Miyauchi K, Harada T, Okita R, Takeshita E, Komaki H, Fujioka K, Yagasaki H, Goto Y-i, Yanaka K, Nakagawa S, Sakaguchi Y, Suzuki T. CO2-sensitive tRNA modification associated with human mitochondrial disease. Nature Communications. 2018; 9: 1875.

[2] Lian H, Wang Q H, Zhu C B, Ma J, Jin W L. Deciphering the Epitranscriptome in Cancer. Trends in Cancer. 2018: S2405803318300219.

[3] Schimmel, Paul. The emerging complexity of the tRNA world: mammalian tRNAs beyond protein synthesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2017.

[4] Thomas J M, Batista P J, Meier J L. Metabolic Regulation of the Epitranscriptome. Acs Chemical Biology. 2019.

[5] Chionh Y H, Mcbee M, Babu I R, Hia F, Lin W, Zhao W, Cao J, Dziergowska A, Malkiewicz A, Begley T J. tRNA-mediated codon-biased translation in mycobacterial hypoxic persistence. Nature Communications. 2016; 7: 13302.

[6] Kimura S, Dedon P C, Waldor M K. Comparative tRNA sequencing and RNA mass spectrometry for surveying tRNA modifications. Nature Chemical Biology. 2020.

[7] Su D, Chan C T Y, Gu C, Lim K S, Chionh Y H, Mcbee M E, Russell B S, Babu I R, Begley T J, Dedon P C. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 2014; 9: 828-841.

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