摘要本文中，開發(fā)出了一種高精度統(tǒng)計(jì)學(xué)模型用于確定商品草藥生產(chǎn)中所使用的洋甘菊的確切類型。該模型是根據(jù) Agilent 7890 GC 和 Agilent 5975 GC/MSD 系統(tǒng)得到的精確 GC/MS數(shù)據(jù)而開發(fā)。樣品的質(zhì)量控制采用主成分分析法 (PCA)，而樣品類別預(yù)測模型的建立是基于偏最小二乘判別分析法 (PLS-DA)。該模型具有識別和預(yù)測準(zhǔn)確性。此外還通過基于 PLS-DA 的模型對據(jù)稱含有洋甘菊的 35 種商品和 11 種精油進(jìn)行了后續(xù)的預(yù)測。

前言洋甘菊作為在世界廣泛使用的藥用植物之一，具有緩解睡眠障礙、痢疾、疝氣、傷口疼痛、黏膜炎和濕疹的功效 [1,2]。洋甘菊的其他藥物屬性還包括抗過敏、抗菌、抗炎和抗痙攣等 [3]。然而，也有報道稱洋甘菊會引發(fā)過敏反應(yīng)，包括皮疹、咽喉腫脹、呼吸短促和過敏癥。遺憾的是，目前并沒有一種普遍接受的洋甘菊表征方法，因而對于含有這種性狀不明確的天然產(chǎn)物的草藥來說，確定和控制它們的質(zhì)量、安全性和功效會變得相當(dāng)困難。實(shí)際上，推廣草藥洋甘菊產(chǎn)品最大的障礙之一是產(chǎn)品摻假。本文介紹了新近發(fā)表的一篇研究 [4]，該研究涉及商品中最常見的三類洋甘菊的化學(xué)組成： 德國洋甘菊 (Matricaria chamomilla L.syn: M. recutita L.); 羅馬洋甘菊 (Chamaemelum nobile (L). All.syn: Anthemis nobilis L.) 和菊花 (Chrysanthemum morifoliumRamat.)。我們開發(fā)出了一種氣相色譜/質(zhì)譜 (GC/MS) 方法，并利用該方法將收集的洋甘菊樣品（包括已驗(yàn)證的植物及其商品和精油）就其易揮發(fā)、非極性的化合物進(jìn)行非目標(biāo)分析。該方法通過 Agilent 7890 GC 和 Agilent 5975 GC/MSD 系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。通過使用自動數(shù)據(jù)處理程序和采用不同標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)篩選工具實(shí)現(xiàn)控制輸入變量、校準(zhǔn)保留時間和簡縮數(shù)據(jù)。PLS-DA 法用于建立對目標(biāo)樣品進(jìn)行分類和辨別的模型。該模型用于評估聲稱含有洋甘菊的商品。同時也用于鑒定與每類洋甘菊相關(guān)的主要標(biāo)志化合物。

實(shí)驗(yàn)部分樣品本文所研究的樣品包括 27 種已驗(yàn)證的植物、35 種固體商品和11 種精油。所有樣品的標(biāo)本都保存于美國密西西比大學(xué)國家天然產(chǎn)物研究中心 (NCNPR) 的植物藥材貯藏室（并具有 NCNPR 登記號）[4]。試劑和標(biāo)樣化學(xué)品和標(biāo)樣按所描述方式獲得和使用 [4]。儀器本研究采用配備 Agilent 7693A 自動液體進(jìn)樣器的 Agilent 7890氣相色譜儀，并與 Agilent 5975 GC/MSD 系統(tǒng)聯(lián)用。表 1 中列出了儀器條件

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樣品前處理固體樣品經(jīng)研磨并混勻，以獲得均勻的基質(zhì)。大約 1 g 的細(xì)粉末經(jīng)準(zhǔn)確稱量后，分散在 4 mL 正己烷溶液中，超聲處理 1 小時。在GC/MS 分析之前采用 Millex GV (0.22 µm) 過濾器過濾上層清液。而對于精油樣品，取 10 µL 樣品溶于 1 mL 正己烷溶液中。然后將內(nèi)標(biāo)正十三烷 (n-C13H28) 加入到每個樣品溶液中，最終濃度為90 µg/mL。

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用 Agilent MSD Productivity ChemStation 軟件 (E.02.02) 采集GC/MS 數(shù)據(jù)。同時使用 NIST 自動質(zhì)譜解卷積和鑒定軟件 (AMDIS)提取 GC/MS 數(shù)據(jù)。把具有相同洗脫曲線和相似質(zhì)譜數(shù)據(jù)的離子鑒定為實(shí)體 (Entity)，并以保留時間 (tR)、峰強(qiáng)度和 m/z 進(jìn)行表征。將每個樣品的 ELU 文件（由 AMDIS 創(chuàng)建）導(dǎo)入到 Mass ProfilerProfessional (MPP) 軟件中，該軟件包含了幾種樣品分類預(yù)測(SCP) 算法。豐度最小設(shè)置為 5000 響應(yīng)值 (Counts)，以用于選擇5-90 分鐘保留時間窗口內(nèi)的實(shí)體做進(jìn)一步分析。0.15 分鐘的保留時間窗口容差范圍和譜型相似性被用來在整個樣品組中進(jìn)行實(shí)體的匹配?？紤]到每個樣品間豐度的差異，使用了內(nèi)標(biāo)物對峰強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理?；谠跇悠分械拇嬖谛院蛥?shù)值（按標(biāo)志篩選）、出現(xiàn)頻率（通過頻率篩選）、不同種類中各自實(shí)體的豐度（通過樣品差異篩選）和單因素方差分析 (ANOVA) 的結(jié)果，對實(shí)體進(jìn)行逐級降維處理。PCA 用于樣品數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，并建立了基于 PLS-DA 的樣品分類預(yù)測模型。通過使用一系列在之前模型訓(xùn)練中使用的 12 種已驗(yàn)證植物樣品和不包含在模型訓(xùn)練中的已知標(biāo)簽商品進(jìn)行交叉驗(yàn)證流程來驗(yàn)證此模型。

結(jié)果與討論數(shù)據(jù)采集由于事先沒有定義目標(biāo)分析物的具體分組，因此采用全掃描模式進(jìn)行非目標(biāo)分析來獲取盡可能多的信息。采用 GC/MS 分析法檢測到已驗(yàn)證洋甘菊植物樣品中的大量化合物。雖然在給定類型洋甘菊植物樣品中的組分濃度稍有一些變動，但是相同種類洋甘菊擁有一致的色譜圖型。不同類型的洋甘菊具有顯著不同的化學(xué)組分分布（圖 1）。

數(shù)據(jù)挖掘MPP 軟件對 2560 種實(shí)體進(jìn)行了分析，強(qiáng)度閾值為 5000 響應(yīng)值。采用逐級篩選程序?qū)Υ聿煌愋脱蟾示盏木咛卣餍詷?biāo)志化合物進(jìn)行鑒定，并在使用 PCA和 PLS DA方法前對數(shù)據(jù)作降維處理。本流程的第一步為“按標(biāo)志篩選”。標(biāo)志是用于標(biāo)示一種樣品中實(shí)體的品質(zhì)，并指示每個樣品中被檢測的實(shí)體是“存在”或處于“臨界”狀態(tài)的屬性。如果在所有樣品中都有該實(shí)體，就無需進(jìn)入分析。只有每個樣品中*的實(shí)體才會被保留作進(jìn)一步分析。第二步篩選中，在“通過頻率篩選”的步驟中，需要實(shí)體在至少一個樣品組（如所有的羅馬洋甘菊樣品組）中*存在，否則將會被移除。第三步為“通過樣品差異篩選”，此篩選基于實(shí)體的豐度變異系數(shù) (CV) 小于 25%。最后的篩選步驟會依據(jù)單因素方差分析計(jì)算出每個實(shí)體的 p 值，然后選擇*重現(xiàn)性的數(shù)據(jù)。p 值截止值取 0.05 用于確保只有各個種類中的實(shí)體間差異具有 95% 的統(tǒng)計(jì)顯著性才能認(rèn)為通過。盡管在實(shí)施篩選程序之前，初始的實(shí)體數(shù)為 2560，但是經(jīng)過逐級篩選后，該數(shù)量降到 50。該篩選程序確保只有*判別能力的實(shí)體才被用來建立預(yù)測模型。