摘要：傳統(tǒng)草藥被用作許多疾病的替代藥物。土壇樹就是這樣一種傳統(tǒng)藥用植物。目前已有多項研究使用到這種植物的提取物，這也證明了其具有治療價值。但是，極少有人嘗試確定這種植物復(fù)雜的代謝物組成。在本應(yīng)用簡報中，我們用有機溶劑和水性溶劑對樣品進行提取，對土壇樹樹皮上的代謝物進行分析和鑒定。通過 Agilent 1260 的分析型餾分收集系統(tǒng)對有機溶劑提取物和水提取物進行餾分收集。并利用 LC/MS 和 GC/Q-TOF 技術(shù)分析每種餾分。使用 HILIC 色譜和三個獨立的正交反向色譜柱進行 LC/MS/MS 分析。使用 AJS 離子源在正離子和負(fù)離子模式下收集數(shù)據(jù)，然后在 METLIN 數(shù)據(jù)庫或 MS/MS 譜庫中進行搜索。那些未能獲得數(shù)據(jù)庫和譜庫匹配的八角楓屬化合物繼而還可以使用安捷倫 MSC 軟件在收錄超過 3000 萬個結(jié)構(gòu)的 ChemSpider數(shù)據(jù)庫中進行搜索。為了鑒定由 GC/Q-TOF 分析結(jié)果所產(chǎn)生的化合物，可以通過 AgilentFiehn GC/MS 代謝組學(xué)譜庫和 Wiley/NIST 譜庫對數(shù)據(jù)進行檢索。借助多個 GC 譜庫的搜索結(jié)果鑒定出 62 種化合物，匹配得分均大于 70。使用兩種技術(shù)共檢測出 1016 種化合物，其中有 511 種化合物被成功鑒定。文獻(xiàn)檢索顯示，511 種化合物中有 81 種對癌癥、微生物感染等傳統(tǒng)疾病具有治療效果。我們的研究表明，使用餾分收集法進行代謝物富集、用雙相溶劑提取以及正交色譜柱固定相進行代謝物分離，并采用互補的 LC/MS 和 GC/MS 檢測，可以提高藥用植物的代謝物檢測范圍。

前言土壇樹是印度阿育吠陀醫(yī)學(xué)和中醫(yī)學(xué)里的一種藥用植物。這種植物通常用于治療癌癥、麻風(fēng)病、糖尿病、癱瘓、微生物感染等多種疾病。植物的每個部分都可口服或者外用，具體取決于所治療的疾病類型。此前已有實驗將這種藥用植物與特定疾病或效能建立起關(guān)聯(lián)1,2。非靶向代謝組學(xué)的綜合評估是指使用LC/MS、GC/MS 和 NMR 等互補的通用分析技術(shù)對所獲樣品中的生化中間體信息進行無偏見分析。影響代謝組綜合評估的因素取決于：• 樣品采集/提取程序中所用的方法• 分餾• 色譜分離固定相• 電離技術(shù)/模式• 采集參數(shù)• 數(shù)據(jù)處理/分析• 數(shù)據(jù)庫/譜庫鑒定5本研究使用正交 LC/MS 和 GC/Q-TOF技術(shù)對這種植物莖皮的代謝物進行綜合分析，包括使用新的譜庫和數(shù)據(jù)庫鑒定代謝物。

實驗部分工作流程表 1 概述了本研究所用的工作流程。

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試劑與材料LC/MS 級的異丙醇、甲醇和乙腈購自 Fluka 公司（德國）。使用 Milli Q 水（Millipore Elix 10 型，美國）進行流動相配制。添加劑（氟化銨、乙酸、甲酸銨、甲酸和乙酸銨）購自 Fluka 公司（德國）。

植物材料采集和提取程序從印度邁索爾附近的土壇樹上采集土壇樹樹皮并將其立即轉(zhuǎn)移至液氮中，儲存在 -80 °C 的溫度下備用。使用研缽和研杵將 2 g 樹皮組織在液氮中研磨為粉末。加入 40 mL 氯仿:甲醇:水比例為 1:2.5:1 (v/v/v) 的脫氣溶液，對樹皮粉末進行提取。將未溶解的樣品用研缽和研杵碾碎 5 min，隨后將其轉(zhuǎn)移至 1.5 mL Eppendorf 管中，在 4 °C 下渦旋混合 5 min。在 20800 rpm 的轉(zhuǎn)速下將該管離心 2 min，將所有管中的上清液合并至一個玻璃樣品瓶內(nèi)。將 1 mL上清液轉(zhuǎn)移至 Eppendorf 管中，加入400 μL 水。將該管渦旋混合 10 s，然后在 20800 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心 2 min。分離水層（上層）和有機層（下層），并分別置于 SpeedVac 濃縮器（Eppendorf 濃縮儀）中蒸干。

餾分收集向蒸干后的水層和有機溶劑層中加入200 μL 各自分餾法所使用的流動相 A和 B（體積比分別為 50:50 和 30:70）（表 2）。對樣品瓶進行超聲處理使化合物重新懸浮。將裝有各種提取物的多個樣品瓶的重懸混合物注入到配備 1 mL 手動 FL 進樣閥（部件號 5067-4191）的 Agilent 1260 Infinity 分析型純化系統(tǒng)中進行 HPLC 分離，將餾分收集在 96 孔板的 45 個孔中，然后用SpeedVac 濃縮器蒸干。

雙重 AJS-ESI-Q-TOF MS 條件將蒸干后的水餾分重新懸浮于 250 μL50:50 甲醇:含 0.2% 乙酸的水溶液中，超聲處理 10 s，將有機溶液餾分懸浮于 30:70 流動相 A:B（表 3 - 有機），然后在 3000 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心 10 min。然后，將 5 μL 重懸餾分注入與 Agilent6540 精確質(zhì)量數(shù) Q-TOF LC/MS 系統(tǒng)相連接的 Agilent 1260 Infinity LC 系統(tǒng)中。使用 API-TOF 參比質(zhì)量溶液試劑盒（部件號 G1969-85001）制備參比溶液。將 10 μL HP921 和 5 μL 嘌呤溶解在 1 L 甲醇:乙腈:含 0.1% 乙酸的水(750:200:50) 溶液中，并使用等度泵在0.4 mL/min 的流速下進行霧化。質(zhì)譜和色譜參數(shù)如表 3A 和 3B 所示。

結(jié)果與討論在本應(yīng)用簡報中，我們使用多分離方案/電離模式和多平臺方法對土壇樹樹皮代謝物進行了綜合分析。最初，我們注入 1 mL 提取物進行水和有機溶劑提取物的餾分收集，以初步分離和富集代謝物。將精確質(zhì)量數(shù) MS 結(jié)果與 METLIN 數(shù)據(jù)庫比對，初步發(fā)現(xiàn) 954 種化合物，其數(shù)據(jù)庫匹配得分 > 90%。文獻(xiàn)檢索顯示，954 種化合物中有 81 種具有治療功效。這些治療性化合物中大多數(shù)是次級代謝物，據(jù)報道這些次級代謝物具有抗癌和抗炎活性（圖 1）。這些化合物屬于各種植物次級代謝物，如萜類、黃酮類、皂苷類、生物堿類、糖苷類等。對所有餾分進行 AutoMSMS 分析，鑒定出449 種化合物。