簡介

作為一種成像技術(shù)，磁共振成像（MRI）廣泛應(yīng)用于日常臨床診療中。為了在檢查過程中增強(qiáng)對(duì)比度，可以使用幾種不同的造影劑。由于五個(gè)或七個(gè)不成對(duì)電子具有出色的順磁性，因此常使用Fe3+、Mn2+或Gd3+。因游離形態(tài)的Gd3+具有毒性，此探針與氨基羧酸一起作為復(fù)合物給藥。大多數(shù)釓造影劑（GBCA）是全身分布的，一些靶向特異性GBCA也正在研究中。

圖1 Gadofluorine P的結(jié)構(gòu)

Gadofluorine P是一種靶向造影劑，對(duì)富含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）具有高親和性，ECM在發(fā)生心肌梗塞（MI）時(shí)分泌。多模式生物成像技術(shù)能夠可視化靶向造影劑的分布。使用激光剝蝕與電感耦合等離子體質(zhì)譜（LA-ICP-MS）以高空間分辨率在元素水平上生成定量圖像，而基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）用于在分子水平上驗(yàn)證研究結(jié)果，提供更多分布信息，例如磷脂或血紅素b的分布。

材料和方法

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

此項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在明斯特大學(xué)醫(yī)院臨床放射學(xué)研究所Moritz Wildgruber教授的研究小組進(jìn)行。使用誘導(dǎo)心肌梗塞六周的小鼠，注射照影劑Gadofluorine P后進(jìn)行MRI檢查。小鼠被處死后，取出心臟并快速冷凍。用冷凍切片機(jī)制備厚度為10μm的切片。

標(biāo)準(zhǔn)品制備

對(duì)于LA-ICP-MS分析，用明膠制備基體匹配標(biāo)準(zhǔn)品，用于外標(biāo) 校正。明膠（10%w/w）添加9種不同濃度，范圍為0至5000 μg/g Gd。另制備了厚度為10μm的標(biāo)準(zhǔn)品切片。

樣品制備

對(duì)于MALDI-MS成像分析，將切片放置于氧化銦錫（ITO）涂層的載玻片上。先用升華法涂敷α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）至組織表面，然后用500μl水和50μl甲醇混合溶液噴霧于組織表面2.5分鐘進(jìn)行再結(jié)晶。

分析條件

對(duì)于LA-ICP-MS分析，使用Tygon管，將ICPMS-2030與激光剝蝕系統(tǒng)LSX-213 G2+（Teledyne CETAC）連接，此系統(tǒng)配有HelEX II池和波長為213nm的Nd-YAG激光。氦氣用于剝蝕池的沖洗和傳輸。ICP-MS 2030配有鎳采樣錐和截取錐。

在碰撞模式下，31P、57Fe、66Zn、158Gd和160Gd的積分時(shí)間為100ms條件下進(jìn)行測(cè)量。每種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用了10個(gè)濃度水平進(jìn)行分析，并且同樣的條件下分析了樣品（表1）。

表1 LA-ICP-MS的實(shí)驗(yàn)條件

MALDI-MS分析使用了配有離子阱-飛行時(shí)間（IT-TOF）質(zhì)譜分析儀iMScope TRIO。選擇正離子模式，質(zhì)量范圍為m/z 700到1200。其他實(shí)驗(yàn)條件列于表2中?；|(zhì)使用iMLayer升華20分鐘。

表2 MALDI-MS的實(shí)驗(yàn)條件

結(jié)果

LA-ICP-MS

用基體匹配標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的外標(biāo)法定量分析結(jié)果顯示，在高達(dá)5000μg/g的濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.997。采用15μm光斑尺寸時(shí)，基于158Gd的檢測(cè)限（LOD）為43ng/g Gd，定量限（LOQ）為140ng/g Gd（根據(jù)Boumans[1]算出）。

圖2 小鼠心臟組織切片的H&E染色

圖2所示為連續(xù)切片的蘇木精伊紅染色結(jié)果，檢測(cè)出心肌梗塞的區(qū)域（以黑線標(biāo)出）。

圖3  兩個(gè)連續(xù)切片的顯微圖像（a.和b.）；經(jīng)LA-ICP-MS測(cè)定的Gd定量分布（c.）；

Gadofluorine P的配體分布（d.）；配體結(jié)構(gòu)及理論峰值（青色條）、MALDI-MS測(cè)定峰值（黑線）（e.）

圖3所示為兩個(gè)連續(xù)切片的顯微圖像（a.和b.）。使用LA-ICP-MS（c.），檢測(cè)到健康心肌中Gd的均勻分布，平均濃度約為50μg/g。梗塞區(qū)的Gd濃度高兩倍，約為110μg/g，最高值可達(dá)370μg/g。

由于靜脈注射造影劑的作用，心室中也存在較高濃度的Gd。

這些分布可以通過MALDI-MS成像進(jìn)行驗(yàn)證（d.）。該實(shí)驗(yàn)中，只能檢測(cè)到Gadofluorine P的質(zhì)子化配體，而不是完整的復(fù)合物（e.）。結(jié)果顯示，主峰m/z 1168.39的質(zhì)譜成像圖與LA-ICP-MS檢測(cè)的Gd分布具有良好的相關(guān)性。在心機(jī)梗塞和心室區(qū)發(fā)現(xiàn)了分子探針的高強(qiáng)度，而健康心肌則顯示出低而均勻的強(qiáng)度。

結(jié)論 

該應(yīng)用表明，元素選擇性（LA-ICP-MS）和分子選擇性（MALDI-MS）成像技術(shù)的組合是可視化心機(jī)梗塞后小鼠心臟組織中靶向釓造影劑分布的有力工具。

通過LA-ICP-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高空間分辨率和定量，并通過MALDI-MS在分子水平上驗(yàn)證了其分布。

參考文獻(xiàn)

[1] P.W.J.M.Boumans, Spectrochimica Acta 1991, 46 B, 641-665.

文獻(xiàn)題目

《Gadofluorine P多模式生物成像分析用于小鼠心肌梗塞研究》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Rebecca Buchholz1、Fabian Lohofer2、Michael Sperling1,3、Moritz Wildgruber4、Uwe Karst1

1 明斯特大學(xué)無機(jī)和分析化學(xué)研究所         

2 慕尼黑工業(yè)大學(xué)放射學(xué)研究所

3 明斯特歐洲物種分析虛擬研究所（EVISA）  

4 明斯特大學(xué)醫(yī)院臨床放射學(xué)研究所

聲明

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