● 樣品準(zhǔn)備：人 K562 細(xì)胞裂解物的酶解產(chǎn)物，來(lái)自SWATH Acquisition performance kit (SCIEX)。進(jìn)樣量范圍為 12.5 ng - 400 ng。

● 液相方法： ACQUITY UPLC  M-Class液相系統(tǒng)（Waters），分析色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 Å, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 Å, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，液相梯度：10 min, 45 min。

● 質(zhì)譜方法：ZenoTOF 7600系統(tǒng)2臺(tái)，兩種采集流程：Zeno DDA、可變窗口Zeno SWATH DIA，樣品平行采集三次。

● 數(shù)據(jù)處理： Zeno DDA數(shù)據(jù)用OneOmics^™軟件包中ProteinPilot^™應(yīng)用程序，使用人類理論數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)。Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA-NN^[1]軟件處理。

在12.5ng - 400 ng進(jìn)樣量范圍內(nèi)，在相同進(jìn)樣量條件下，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量約為Zeno DDA的 2 倍， 2 臺(tái) ZenoTOF^™ 7600 系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果一致。進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)種類比較，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質(zhì)幾乎覆蓋了Zeno DDA 鑒定到的蛋白質(zhì)。

相比于通過(guò)MS1數(shù)據(jù)進(jìn)行定量的Zeno DDA策略來(lái)說(shuō)，Zeno SWATH DIA策略可產(chǎn)生豐富的MS/MS數(shù)據(jù)，因此可獲得更可靠、更明確的定量數(shù)據(jù)。使用 Zeno SWATH DIA 工作流程時(shí)，無(wú)論使用譜圖庫(kù)還是Library-free的數(shù)據(jù)處理策略，定量CV < 20%的蛋白質(zhì)均占總鑒定蛋白質(zhì)約90% 。三種不同數(shù)據(jù)處理方法的鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量相似，該結(jié)果顯示了Library-free處理方法的能力。

隨后比較Library-free處理生成的結(jié)果與使用譜圖庫(kù)處理的結(jié)果，維恩圖（圖 4）顯示二者得到的蛋白質(zhì)鑒定信息非常相似，進(jìn)一步增加了Library-free方法的可信度。

使用快速 10 min液相梯度重復(fù)本研究，以確認(rèn) Zeno SWATH DIA 工作流程在更快的液相梯度中鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量的提升倍數(shù)。相比于 Zeno DDA 方法， 45 min液相梯度，Zeno SWATH DIA 方法蛋白質(zhì)鑒定量提升約2倍（圖 5）。隨著液相梯度加快， 使用Zeno SWATH DIA可獲得更大蛋白質(zhì)鑒定增益，蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量增加到 2.5倍 -3 倍。因此，當(dāng)進(jìn)行大樣本分析時(shí)，更適合選用Zeno SWATH DIA工作流程。

文獻(xiàn)：

[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.

[2] Rosenberger G et al (2014) A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific data. 1, 140031.