摘要：基因毒性雜質(zhì)的測定是制藥行業(yè)非常關注的問題，定量測定的主要難點在于實現(xiàn)足夠高的靈敏度。由于多反應監(jiān)測（MRM）具有高靈敏度和高選擇性，串聯(lián)質(zhì)譜技術被用于對這類雜質(zhì)進行定量。采用快速色譜可以實現(xiàn)高通量，并耗費較短的分析時間，并且可以提高色譜分離度

本研究使用安捷倫 6410串聯(lián)質(zhì)譜和 1200系列 RRLC，對氯己定中的 4-氯苯胺（一種降解產(chǎn)物）進行了定量測定。在0.3 ng/mL 到 1000 ng/mL 的寬濃度范圍內(nèi)線性相關系數(shù)> 0.9998。檢測限（LOD）為 0.2 ng/mL，定量限（串聯(lián)質(zhì)譜）為 0.3 ng/mL。

前言芳香胺類由于具有親電性，能與 DNA 形成強共價鍵，從而阻止了 DNA 的正確復制，被認為可以導致基因突變。4-氯苯胺是氯己定 (1, 1'-(己烷-1, 6-)雙胍基])的降解產(chǎn)物，后者是牙科廣泛使用的活性組分。加熱可以促進 4-氯苯胺的生成 1。該化合物毒性很強，可以導致溶血和高鐵血紅蛋白血癥 2,3。這說明了建立一種對氯己定中 4-氯苯胺穩(wěn)定而靈敏的定量方法非常重要。本應用報告報導了一種簡便而靈敏的LC/ESI/MSMS 方法，能夠檢測氯己定中0.2 ng/mL 濃度水平的 4-氯苯胺。氯己定和 4-氯苯胺的分子結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。

實驗化學藥品及試劑氯己定 和 4-氯苯胺購自 Sigma-Aldrich 公司。所有溶劑均為 HPLC 級。甲醇購自Merck 公司，甲酸購自 Fluka 公司，采用Millipore 超純水。儀器和色譜條件所有分析均使用安捷倫 6410B 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜與 1200 系列 RRLC 系統(tǒng)聯(lián)用。RRLC 系統(tǒng)組件包括安捷倫 1200 系列二元泵 SL，配置脫氣機，安捷倫 1200 系列自動進樣器 SL 和安捷倫 1200 系列柱溫箱SL。用安捷倫 MassHunter 工作站軟件（版本：B.01.04）進行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。

所有色譜分離均采用安捷倫 ZORBAXEclipse Plus C18, 4.6 mm × 100 mm,1.8 µm 色譜柱。 流動相有機相為含 0.1%甲酸的甲醇，水相為含 0.1%甲酸的水。線性梯度從 50%有機相開始，三分鐘至 70%。繼續(xù)維持 B 百分含量 1 分鐘。梯度后時間為 3 分鐘。用自動進樣器進樣 6 µL，打開沖洗口沖洗 10 秒鐘。樣品溫度設置為 15℃。二元泵流速為 700 µL/min。柱溫箱設置在40℃。稀釋液是水相和有機相 1:1 預先混合的溶液。質(zhì)譜參數(shù)列于表 1。4-氯苯胺的監(jiān)測離子為 m/z: 128 和 93 (定量)、 m/z: 128 和 111 (定性)， 氯己定為m/z: 505.4 和 184.3。所有離子的駐留時間均為 200 ms/離子。樣品制備用稀釋劑將濃度為 500 μg/mL 的 4-氯苯胺儲備液稀釋成需要的濃度。配制的線性濃度分別為 0.2 (LOD), 0.3 (LOQ), 0.4, 0.5,0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10,25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000 ng/mL4-氯苯胺。每個濃度重復進樣 3 次，用其響應值繪制線性曲線。

線性范圍內(nèi)各濃度的準確度（以百分比表示）良好，平均值為 102.2 ± 9%。所有濃度的準確度值列于表 2。

結(jié)論我們建立了穩(wěn)定而靈敏的氯己定中 4-氯苯胺的 LC/ESI/MSMS 定量測定方法。該方法具有較寬的線性范圍 0.3 ng/mL (LOQ)到 1000 ng/mL，相關系數(shù)>0.9998。所測LOD 為 0.2 ng/mL。 各線性水平的濃度準確度約為 102.2 ± 9.7%。實驗表明，安捷倫6410B 三重四極桿 LC/MS 能夠精確測定痕量基因毒性雜質(zhì) 4-氯苯胺