導(dǎo)讀

抗體藥物在臨床上主要用于癌癥、自身免疫、代謝和傳染病等疾病的治療。與小分子藥物相比，抗體藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄具有獨特的藥代動力學(xué)特征。2020版《抗腫瘤生物類似藥治療藥物監(jiān)測藥學(xué)專家共識》中多數(shù)專家強烈推薦對其進行監(jiān)測，以實施個體化治療策略。 

納米表面分子導(dǎo)向限制性酶解- nSMOL（nano-Surface and Molecular Orientation Limited Proteolysis）技術(shù)是島津開發(fā)的革新性技術(shù)，可以選擇性酶解Fab 區(qū)域特征肽段，克服了全酶解技術(shù)及ELISA法諸多缺點，具有更好的選擇性和重現(xiàn)性，是復(fù)雜基質(zhì)中抗體藥物定量的新利器。

突破傳統(tǒng)方案，nSMOL技術(shù) – 抗體藥物定量新視野

以往對抗體藥物的檢測主要是采用ELISA試劑盒完成，但ELISA方法存在開發(fā)時間長、準確性一般、假陽性率高、線性范圍窄等問題。而LC-MS/MS方法可以很好地彌補ELISA法的不足，但是如果前處理方法不夠成熟，面對復(fù)雜的基質(zhì)組分，常導(dǎo)致選擇性和重現(xiàn)性不佳、檢測耗時或靈敏度不理想的情況。

01 技術(shù)原理

nSMOL技術(shù)同時彌補了ELISA法及傳統(tǒng)全酶解LC-MS/MS法的不足，技術(shù)原理如圖1所示，其利用胰酶納米顆粒與固化樹脂之間孔徑的差異，限制胰蛋白酶與抗體藥物的接觸區(qū)域，可以選擇性酶解Fab 區(qū)域特征肽段。

圖1. nSMOL技術(shù)選擇性酶解原理

摘自Iwamoto N. et. al.Analyst, 2014, 139, 576-580

02 技術(shù)優(yōu)勢

nSMOL技術(shù)能確保獲得靶標蛋白特異性肽段，降低樣品的復(fù)雜程度，克服了傳統(tǒng)溶液全酶解技術(shù)中存在的酶解產(chǎn)物復(fù)雜、酶解效率低、酶解重現(xiàn)性差，內(nèi)源性干擾嚴重等問題，從而表現(xiàn)出良好的選擇性和重現(xiàn)性。與ELISA法相比（見表1），其開發(fā)周期更短，定量特性更適合高靈敏、高特異性、多種抗體藥物的高通量測定。

03 應(yīng)用廣闊

nSMOL技術(shù)開啟了抗體藥物定量分析的新視野，經(jīng)過島津與客戶的不斷研究探索，該技術(shù)已在不同治療用途抗體藥物的研發(fā)、質(zhì)控、臨床治療藥物監(jiān)測中得到成熟應(yīng)用。圖2展示了國內(nèi)外相關(guān)應(yīng)用成果。截至目前，全球已上市100余種抗體類藥物，nSMOL技術(shù)應(yīng)用前景十分廣闊。

圖2. 國內(nèi)外相關(guān)應(yīng)用

創(chuàng)新臨床應(yīng)用，nSMOL技術(shù)實現(xiàn)多種炎癥治療性抗體藥物同時監(jiān)測

臨床上多種抗體藥物均可用于炎癥性免疫疾病的治療，因此同時定量監(jiān)測人血液中多種抗體藥物濃度的分析方法，具有迫切的臨床需求。

01 nSMOL臨床應(yīng)用

nSMOL技術(shù)發(fā)明人 - 島津生命科學(xué)研究中心Takashi Shimada博士及其科研團隊，2019年在《Journal of Immunological Methods》期刊上發(fā)表文章，使用nSMOL技術(shù)開發(fā)了9種抗體和Fc-融合蛋白(英夫利昔單抗、阿達木單抗、尤特克單抗、戈利木單抗、依庫珠單抗、依那西普和阿巴西普、托珠單抗和美泊利單抗)的LC-MS生物分析方法，通過臨床試驗進一步論證了該技術(shù)在多種抗體藥物濃度同時監(jiān)測應(yīng)用中的巨大價值。

該文章中樣品的處理方式采用了改進的nSMOL反應(yīng)條件, 如圖3所示。

圖3. 9種抗體和Fc-融合蛋白的nSMOL樣本處理流程

首先樣品在緩沖液中與結(jié)合有Protein A的樹脂混合，樣品中的抗體被親和富集。第二步，富集后的樹脂與含固定化胰酶納米顆?；旌?，其表面固化的胰蛋白酶可以與樹脂所富集抗體的Fab區(qū)域進行充分接觸，特別是Fab區(qū)域中的CDR相關(guān)特征肽段被選擇性酶解下來，洗脫后進行LC-MS/MS定量。為提高低敏抗體托珠單抗和美泊利反應(yīng)效率，采用了250 mM TCEP-HCl水溶液的酸化還原加速條件進行處理，得到了良好的結(jié)果。

9種抗體和Fc-融合蛋白通過特征肽段的LC-MS/MS檢測，獲得了其典型MRM色譜圖（圖4a,圖4b），9種藥物具有良好的靈敏度、色譜保留及峰形。

圖4. 9種抗體和Fc-融合蛋白藥物典型MRM色譜圖

根據(jù)日本厚生勞動省藥品和食品安全局評估和許可司發(fā)布的《藥物開發(fā)中生物分析方法驗證指南》進行了詳細驗證。驗證結(jié)果顯示該方案的定量靈敏度、線性范圍、重復(fù)性、準確性等指標均滿足該類抗體治療藥物監(jiān)測需求。

02 臨床研究

2017年11月至2019年1月，京都大學(xué)醫(yī)院招募了45名患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)或炎癥性腸病(IBD)的日本患者參加這項研究。作者使用臨床患者樣本對比分析了9種藥物同時監(jiān)測與單個監(jiān)測方法所得結(jié)果的相關(guān)性。部分結(jié)果見圖5。

圖5. 兩種方法定量結(jié)果相關(guān)性分析

線性回歸擬合Pearson相關(guān)分析表明，兩種監(jiān)測方法所得結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性，且對照組各數(shù)據(jù)在95%置信區(qū)間內(nèi)具有較高的重現(xiàn)性和較低的變異。

作者經(jīng)過嚴苛的方法學(xué)驗證及臨床實驗，證明了基于nSMOL技術(shù)的LC-MS/MS法可以同時定量人血清中多種抗體及Fc-融合蛋白藥物，并應(yīng)用于治療藥物監(jiān)測，助力患者個體化精準用藥。

結(jié)語

nSMOL技術(shù)結(jié)合島津三重四極桿質(zhì)譜儀能夠較好地解決單克隆抗體藥物在定量分析中的難題，是抗體藥物血藥濃度監(jiān)測不可或缺的高效工具。該方案為治療性抗體藥物的治療藥物監(jiān)測(TDM)提供了更加簡便高效、準確穩(wěn)定的檢測方法，期待其臨床應(yīng)用能夠助力個體化治療策略的探索與實踐。

撰稿人：任彪

文中推薦技術(shù)方法方案僅用于醫(yī)學(xué)專業(yè)人士技術(shù)交流，不作為臨床診斷依據(jù)。