研究背景

對(duì)于具有多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)的中藥來(lái)說(shuō)，多組分共存時(shí)主要成分的體內(nèi)過(guò)程研究對(duì)揭示中藥體內(nèi)復(fù)雜藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有重要意義。但由于中藥成分的多樣性和各成分間理化性質(zhì)的差異性，中藥生物樣品中多成分的同步、靈敏、快速定量檢測(cè)仍是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，均相液液萃取方法已經(jīng)成為蛋白分離純化的重要手段之一。

該研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加一定濃度鹽或糖的水溶液，可使均相混合體系(如由血漿和有機(jī)相乙腈組成) 分層，同時(shí)利用相似相溶原理對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行萃取。作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)向有機(jī)溶劑-血漿均相體系加入質(zhì)譜友好的揮發(fā)性鹽(如甲酸銨、乙酸銨)的鹽析輔助均相液液萃取方法兼具操作步驟簡(jiǎn)單、基質(zhì)干擾低、提取回收率穩(wěn)定的特點(diǎn)，可同步對(duì)多種不同極性的待測(cè)物進(jìn)行提取分離，在保證選擇性和靈敏度的同時(shí)提高了分析方法的通用性。

01

方法與結(jié)果

目標(biāo)待測(cè)化合物中(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，3種生物堿類成分和3種萜類成分在質(zhì)譜正離子模式下有較好響應(yīng)，而3種黃酮類成分在負(fù)離子模式的靈敏度更佳。利用島津LCMS-8050高速正負(fù)極切換的性能特點(diǎn)，在保證高靈敏度的同時(shí)，單次分析中同時(shí)進(jìn)行正負(fù)離子的多通道MRM監(jiān)測(cè)(圖2)。

圖1 柳胺酚內(nèi)標(biāo)和目標(biāo)待測(cè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 大鼠血漿QC樣品中LIQ、DHE、ILIQ、LIQN、IS、RVN、LIM、OBA、EVO和RUT的代表性MRM色譜圖

在樣品前處理方法優(yōu)化過(guò)程中，作者對(duì)比了6種前處理步驟對(duì)血漿樣品中目標(biāo)待測(cè)化合物基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的影響，6種方法分別為：(1) 甲醇蛋白沉淀(方法A)，(2) 乙腈蛋白沉淀(方法B)，(3)甲基叔丁基醚-二氯甲烷液液萃取(方法C)，(4)乙酸乙酯-正丁醇液液萃取(方法D)，(5)乙酸銨鹽析輔助均相液液萃取(方法E)，(6)葡萄糖糖析輔助均相液液萃取 (方法F)。結(jié)果顯示，對(duì)于9種目標(biāo)待測(cè)化合物，使用乙腈蛋白沉淀的方法基質(zhì)干擾明顯；使用弱極性萃取溶液的液液萃取方法對(duì)極性較大的甘草苷和異甘草苷提取回收率低，進(jìn)而影響分析方法的定量下限；而使用揮發(fā)性鹽溶液和有機(jī)溶劑的鹽析輔助均相液液萃取方法，既可以降低基質(zhì)干擾又能保證各待測(cè)成分的提取回收率，對(duì)比另外兩種原理的前處理方法，擴(kuò)大了分析物的適用范圍(圖3)。

圖3 空白血漿加標(biāo)QC樣品的萃取方法基質(zhì)效應(yīng)和回收率結(jié)果

作者還對(duì)鹽析輔助均相液液萃取方法的揮發(fā)性鹽種類和濃度進(jìn)行了探究。總體上，同濃度的甲酸銨和乙酸銨溶液對(duì)鹽析輔助均相液液萃取方法基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的影響相似(圖4)，但對(duì)待測(cè)成分精密度和準(zhǔn)確度的影響略有差異。此外，對(duì)于乙腈-血漿的均相體系，當(dāng)體系中乙酸銨濃度增加到0.5 M后才會(huì)出現(xiàn)分層趨勢(shì)(圖5)。高濃度鹽溶液的加入有利于均相體系鹽析分層，但較高的鹽濃度會(huì)降低負(fù)離子模式下的黃酮類成分的檢測(cè)靈敏度。

圖4 空白血漿加標(biāo)QC樣品的SALLE方法基質(zhì)效應(yīng)和回收率結(jié)果

圖5 乙酸銨濃度對(duì)SALLE性能的影響

最后，對(duì)優(yōu)化的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，并成功應(yīng)用于中藥吳茱萸-甘草配伍的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究中。

02

 總結(jié)與討論

本研究開(kāi)發(fā)優(yōu)化了一種操作步驟簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、化合物適用范圍廣的血漿樣品LC-MS/MS高通量分析方法，利用島津LC-30AD高速梯度精密送液和LCMS-8050高速正負(fù)極切換的技術(shù)特點(diǎn)，同步對(duì)極性差異較大的3種生物堿類、3種萜類和3種黃酮類成分進(jìn)行了定量測(cè)定。

LCMS-8050

03

文獻(xiàn)簡(jiǎn)介

文獻(xiàn)題目

《Simultaneous LC-MS/MS bioanalysis of alkaloids, terpenoids, and flavonoids in rat plasma through salting-out-assisted liquid-liquid extraction after oral administration of extract from Tetradiumruticarpum and Glycyrrhiza uralensis: a sample preparation strategy to broaden analyte coverage of herbal medicines》

使用儀器

LCMS-8050，LC-30AD

作者

Manlin Li¹, Hanxue Wang¹, Xiaohan Huan^1, Ning Cao¹, Huida Guan¹, Hongmei Zhang², Xuemei Cheng¹, Changhong Wang¹*

1. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Shanghai Key Laboratory of Compound Chinese Medicines, 1200 Cailun Road, Shanghai 201203, China

2. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

* Corresponding author. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China. Tel: 086-021-51322511, Fax: 086-021-51322519, E-mail: wchcxm@shutcm.edu.cn; wchcxm@hotmail.com (Changhong Wang).

原標(biāo)題：通過(guò)鹽析輔助均相液液萃取方法和LC-MS/MS技術(shù)同步對(duì)大鼠血漿中的生物堿類、萜類和黃酮類成分進(jìn)行定量分析

上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥研究所

文章發(fā)表于Analytical and Bioanalytical Chemistry

文章鏈接：https://doi.org/10.1007/s00216-021-03568-1

致謝

本研究得到《上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃》[ZY(2018-2020)-CCCX-5002]的資助。

聲明

1、本文不提供文獻(xiàn)原文。

2、所引用文獻(xiàn)僅供讀者研究和學(xué)習(xí)參考，不得用于其他營(yíng)利性活動(dòng)。

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